Progetto Iside – fecondazione assistita
Tecniche di PMA

Tempistiche della crescita embrionaria: dall’ovocita all’embrione/blastocisti

30 giugno 2017

I trattamenti di II livello della Procreazione Assistita prevedono la fecondazione dei gameti femminili, ovvero gli ovociti, con i gameti maschili, ovvero gli spermatozoi, all’esterno dell’organismo femminile. Perché questa procedura sia possibile, è dunque necessario che gli ovociti siano prelevati dalle ovaie della paziente, dopo un’opportuna stimolazione ormonale. Successivamente, gli ovociti vengono trasferiti al laboratorio del Centro di procreazione assistita, vengono valutati e messi in fecondazione con gli spermatozoi del partner. Dopo la formazione degli embrioni, si attende il giorno del trasferimento degli stessi nell’utero della paziente.

 

Le varie fasi dei trattamenti di II livello di Procreazione assistita dunque, si possono così riassumere:

  • stimolazione ormonale controllata, secondo un protocollo di stimolazione, per indurre una crescita multipla dei follicoli ovarici che contengono gli ovociti;
  • prelievo degli ovociti per via transvaginale;
  • fecondazione in vitro, presso il Laboratorio
  • coltura embrionaria;
  • trasferimento degli embrioni in cavità uterina.

 

Stimolazione

In cosa consiste la stimolazione ormonale controllata?

La stimolazione ormonale controllata consiste nella somministrazione di farmaci, chiamati gonadotropine o comunemente ormoni, che stimolano la crescita di più follicoli ovarici e la maturazione degli ovociti in essi contenuti. I protocolli di stimolazione ormonale controllata sono numerosi e tutti hanno dunque la finalità di incrementare i livelli nel sangue degli ormoni, per permettere una crescita e maturazione follicolare multipla, sostituendosi in questo modo al naturale processo di selezione fisiologica di un unico follicolo dominante.

A tutt’oggi non è stato identificato alcun farmaco o alcuno schema terapeutico unico, che abbia consentito di ottenere una risposta ovarica e/o dei risultati finali di trattamento nettamente superiori rispetto agli altri. E’ necessario infatti sottolineare come esista un’ampia variabilità biologica, fra le pazienti che si accostano alla Procreazione assistita, nel rispondere ad un identico stimolo esterno. Questo aspetto, dunque, rende estremamente complessa l’individuazione di trattamenti standardizzati.

L’esperienza dei singoli centri appare il fattore determinante nell’adozione di determinati protocolli, poiché la migliore resa della crescita follicolare multipla, si deve necessariamente correlare con le particolari situazioni operative e con gli standard individualmente raggiunti.

Qualunque strategia si adoperi, gli obiettivi della induzione della crescita follicolare multipla sono:

  • la maturazione di follicoli multipli, morfologicamente e funzionalmente adeguati;
  • il recupero di multipli ovociti di “buona qualità”;
  • la sincronizzazione dello stadio di maturazione dell’endometrio e della crescita degli embrioni.

 

Prelievo

Come avviene il prelievo degli ovociti?

Il prelievo degli ovociti, chiamato comunemente pick up, avviene 34-36 ore dopo la somministrazione della gonadotropina corionica hCG. Viene eseguito in sala operatoria per via transvaginale sotto guida ecografica, in anestesia locale o lieve sedazione. Consiste nell’aspirazione del liquido follicolare presente nei follicoli che si sono formati dopo la stimolazione ormonale. Il liquido follicolare, raccolto in apposite provette, viene immediatamente passato al laboratorio. Gli operatori cercano infine gli eventuali ovociti presenti al loro interno.

 

Fecondazione

Quando avviene la fecondazione?

Dopo il prelievo ovocitario, gli ovociti recuperati vengono lasciati in incubatori a 37°C e 5-6% CO2 presenti in laboratorio fino al momento della fecondazione. Nel frattempo viene richiesta la produzione del liquido seminale al partner maschile.

Dopo 4/5 ore dal prelievo gli ovociti e gli spermatozoi vengono messi in fecondazione secondo due diverse tecniche: la FIV, acronimo che sta ad indicare la Fecondazione In Vitro (più comunemente conosciuta come FIVET: Fecondazione in Vitro con Embryo Transfer), o la ICSI, ovvero l’Iniezione Intra-citoplasmatica del singolo spermatozoo, all’interno dell’ovocita.

La FIV consiste nel mettere a contatto gli ovociti prelevati con gli spermatozoi del partner precedentemente preparati. Trattasi di ovociti nella loro integrità e che pertanto conservano il complesso di cellule che li circonda. Sarà lo spermatozoo da solo a farsi strada tra le cellule, a penetrare nell’ovocita e a fecondarlo.

La ICSI è una tecnica di micromanipolazione e consiste nell’iniezione di un singolo spermatozoo, selezionato sulla base della morfologia e della motilità, all’interno di un ovocita “maturo” per ottenere la fecondazione. La ICSI presuppone pertanto un ovocita maturo: questo ovocita viene individuato al microscopio a seguito di un processo detto di denudazione e che consiste nella rimozione del complesso di cellule che sta attorno ad esso. Solo gli ovociti che verranno classificati maturi, potranno essere utilizzati per la ICSI. Anche questa procedura avviene al microscopio in apposite piastre.

Dopo l’iniezione, gli ovociti vengono riposti nuovamente negli incubatori e ci rimarranno fino al momento del controllo dell’avvenuta fecondazione.

FIV o la ICSI: come si sceglie la tecnica da utilizzare per l’inseminazione degli ovociti?

La scelta su quale tecnica adottare per l’inseminazione è dettata da diversi fattori che riguardano la qualità del liquido seminale, la qualità degli ovociti e non da ultimo il quadro clinico generale della coppia.

Le indicazione all’utilizzo della FIV sono:

  • l’infertilità tubarica
  • una lieve patologia del liquido seminale
  • le alterazione dell’ovulazione
  • precedenti fallimenti con le IUI, inseminazioni intrauterine (tecniche di I livello)

Le indicazioni all’utilizzo della ICSI sono:

  • una grave patologia del liquido seminale
  • precedenti fallimenti con la FIV

Con la ICSI gli operatori riescono a valutare la maturità e l’aspetto degli ovociti subito dopo la denudazione dal complesso di cellule del cumulo; è possibile con la FIV?

Utilizzando la tecnica della ICSI, che prevede la denudazione, risulta immediata la selezione degli ovociti per la fecondazione. La denudazione degli ovociti dal complesso di cellule che li circondano, è infatti un ottima procedura che permette agli operatori di avere fin da subito un’idea di quanti siano gli effettivi ovociti maturi da poter utilizzare per la fecondazione con gli spermatozoi. Con la tecnica FIV, invece, gli operatori non possono procedere alla denudazione. Effettuano una valutazione del complesso cumulo-ovocita, che risulta grossolana perché l’ovocita, in parte nascosto, non è ben visualizzabile e perché, a causa della somministrazione della terapia ormonale e del conseguente sviluppo di numerosi follicoli, spesso si realizza un’asincronia tra lo sviluppo delle cellule del cumulo e l’ovocita: quindi lo sviluppo ovocitario, potrebbe non essere in sintonia con quello delle cellule che lo circondano. La riduzione della possibilità di selezionare gli ovociti idonei all’inseminazione, potrebbe essere una delle cause di una diminuita percentuale di fecondazione.

La ICSI è una tecnica più invasiva rispetto alla FIV?Gli ovociti possono degenerarsi dopo la microiniezione?

La ICSI consiste nell’iniezione all’interno dell’ovocita dello spermatozoo prescelto dall’operatore del Laboratorio. Può risultare dunque più invasiva in quanto non è il singolo spermatozoo che penetra naturalmente nell’ovocita, ma viene forzata la sua entrata con le apposite micropipette. Può capitare che qualche ovocita si degeneri dopo la ICSI od anche proprio durante l’iniezione stessa. Le cause possono essere ricercate soprattutto nella qualità dell’ovocita, e nello specifico nel citoplasma e nella resistenza della membrana.

Quando si può sapere se un ovocita è stato fecondato dallo spermatozoo?

Il giorno dopo l’inseminazione, dopo 16/18 ore, viene effettuato il controllo delle fecondazioni.

Gli ovociti che presentano due pronuclei, due strutture circolari una di origine materna e una paterna contenenti il materiale genetico, e due globuli polari, sono fecondati regolarmente e sono definiti zigoti. Si distinguono dagli ovociti non fecondati, che non presentano i pronuclei e dagli ovociti fecondati in modo anomalo, che presentano 3 o più pronuclei. Verificata la fecondazione, gli zigoti sono nuovamente riposti negli incubatori.

 

Qual è il destino degli ovociti non fertilizzati?

Può capitare che dopo la fecondazione in vitro sia utilizzando la tecnica FIV, che la ICSI, alcuni ovociti non si siano fecondati. In questi casi, gli ovociti vengono smaltiti e non posso essere utilizzati per altri scopi.

 

Coltura

Chi, dove e in che modo si prende cura degli embrioni in attesa del transfer?

Gli embrioni formati dall’unione degli ovociti con gli spermatozoi sono estremamente sensibili. L’operatore per eccellenza che se ne prende cura è l’embriologo. Il suo compito è fondamentalmente quello di minimizzare gli stress causati agli embrioni dalla coltura “in vitro”, ovvero fuori dall’ambiente naturale, agendo proprio sull’ambiente esterno.

Gli embrioni “in vitro” sono mantenuti in piastre contenenti dei terreni liquidi nutritivi. Ogni paziente ha la propria piastra contrassegnata con il proprio codice identificativo. Gli embrioni, nelle piastre, possono essere messi in coltura singolarmente in gocce o in gruppo nella stessa goccia. Ogni laboratorio ha per la coltura i propri protocolli standardizzati e validati. I terreni contengono nello specifico: Acqua ultrapura, Aminoacidi, Sali inorganici, Nutrienti (glucosio, piruvato, lattato), Antibiotici e Albumina Umana.

Le piastre con gli embrioni sono riposte all’interno degli incubatori, ovvero dei contenitori che mimano l’utero materno: la temperatura all’interno deve essere costante a 37°C e l’atmosfera deve avere il 5/6% di CO2.

E’ fondamentale che per assicurare una crescita ottimale degli embrioni, gli embriologi controllino che non vi siano, durante tutti gli stadi di sviluppo, eccessive variazioni di: Temperatura, pH (garantito dall’atmosfera), nutrienti.

Non da meno esposizioni prolungate alla luce ed ad alti livelli di O2 devono essere assolutamente evitate per non compromettere la buona crescita degli embrioni.

Con quali tempistiche crescono gli ovociti fecondati?

Lo sviluppo dell’embrione, che prevede la formazione di più cellule, chiamate blastomeri, coinvolge una serie di divisioni dell’ovocita fecondato.

Una regolare crescita a 2 cellule è osservata a 22-24 ore dall’inseminazione, una crescita a 4 cellule è osservata attorno alle 36-50 ore ed infine una crescita a 8 cellule viene osservata a 72 ore. Le cellule continuano ad essere ben definite e facilmente valutabili fino allo stadio di 10-12 cellule. A partire dalla quarta giornata dopo l’inseminazione l’embrione inizia a compattarsi per dare origine alla morula. Passati 5 o 6 giorni dall’inseminazione, l’embrione raggiunge lo stadio di blastocisti, in cui sono presenti circa 200 cellule.

Gli embrioni che si formano da un pool di ovociti di una stessa paziente, crescono tutti contemporaneamente dopo l’inseminazione?

Non è automatico che un pool di ovociti di una stessa paziente, una volta inseminati, dia origine ad embrioni che crescano contemporaneamente alla stessa velocità. Ci possono essere embrioni più veloci, più lenti ed embrioni che si arrestano durante la crescita. Questa differenza nello sviluppo può essere determinata da diversi fattori non solo di natura genetica, ma anche ambientali.

L’utilizzo di sofisticate tecnologie in grado di monitorare la crescita degli embrioni, ha permesso di definirlo come un’identità dinamica e soggetta a variazioni continue. Il grado di plasticità degli embrioni sembra essere una loro caratteristica intrinseca condizionata dai meccanismi di divisioni cellulari, dalla qualità del citoplasma ovocitario, dall’allineamento dei pronuclei e dalle condizioni nutritive in vitro.

Come vengono valutati gli embrioni?

I fattori più importanti della valutazione morfologica degli embrioni sono: il numero di cellule, la percentuale di frammentazioni, l’uniformità nella dimensione delle cellule e la simmetria nella disposizione delle stesse. Fondamentale è sottolineare che non esiste una diretta correlazione tra la valutazione morfologica e la percentuale di successo del trattamento: una perfetta morfologia non è sinonimo di gravidanza, così come una morfologia scadente non è sinonimo di fallimento di gravidanza. Intervengono infatti molteplici fattori oltre alla qualità dell’embrione come i livelli ormonali, lo spessore dell’endometrio e altre condizioni fisiologiche della paziente.

 

Trasferimento

Quando avviene il trasferimento degli embrioni in cavità uterina?

 

Il trasferimento degli embrioni in cavità uterina può essere effettuato dal giorno dopo l’inseminazione fino allo stadio di blastocisti.

La decisione relativa al giorno in cui effettuare il trasferimento è dettata da diversi fattori che riguardano sia la paziente che gli embrioni. Per quanto riguarda la paziente viene valutata la sua storia clinica, il tipo di stimolazione che ha effettuato, la risposta alla suddetta stimolazione e l’età. Per quanto riguarda gli embrioni si considerano il numero e la qualità degli stessi: non tutti gli embrioni che si ottengono dall’inseminazione, infatti, riescono a crescere fino allo stadio di blastocisti.

 

Il trasferimento degli embrioni è una pratica dolorosa?

 

Il Trasferimento degli embrioni in cavità uterina non è una pratica dolorosa: non prevede anestesia e dura pochi minuti. Posizionato lo speculum, tamponato leggermente il collo dell’utero con dell’acqua sterile, il ginecologo procede con l’inserimento degli embrioni attraverso un apposito catetere.

 

Esistono dei modi non invasivi di selezionare gli embrioni “migliori”?

La scienza che si occupa di ricercare metodi non invasivi di selezione degli embrioni è la metabolomica che studia le variazioni metaboliche delle cellule degli organismi viventi. Gli embrioni sono formati da cellule che, durante la coltura nei terreni specifici, utilizzano le sostanze nutritive rilasciando come prodotto finale i cosiddetti metaboliti. Questo processo di rilascio porta come conseguenza delle variazioni nella composizione dei terreni stessi. Quello che ci si aspetta dunque è che analizzando i metaboliti prodotti, si possano ricavare informazioni preziose sulla vitalità, sulle potenzialità e non da meno sulle possibilità di impianto degli embrioni. I cambiamenti nel terreno sono lo specchio dunque dell’attività e dell’efficienza del metabolismo degli embrioni. Ad oggi la metabolomica rappresenta una promettente prospettiva futura, anche se sono ancora necessari studi per sviluppare un sistema standardizzato che la rendano una tecnica valida ed applicabile sul piano clinico.

Dott.ssa Zicchina