Il ruolo del biologo nel laboratorio di PMA

Il Biologo o il Biotecnologo assumono la qualifica di Embriologo Clinico dopo aver effettuato un determinato numero di tecniche di I e II livello e aver acquisito un’esperienza di almeno 2 anni in un centro di Procreazione Medicalmente Assistita (PMA), come definito e richiesto nel “Documento per la definizione del profilo professionale dell’embriologo clinico della Società Italiana Embriologia Riproduzione e Ricerca” che ha inquadrato la posizione di questa figura professionale a luglio del 2018.

Affinché un Biologo possa rivestire la qualifica di Embriologo Responsabile di Laboratorio Embriologico è necessario che abbia maturato un’esperienza di almeno 6 anni e deve inoltre “aver eseguito in prima persona almeno 200 procedure di secondo livello (ICSI/FIV) e poter dimostrare di aver partecipato a specifiche attività di formazione per la gestione della qualità e della sicurezza nei laboratori di PMA”.

All’interno di un centro PMA, l’Embriologo si occupa della diagnosi d’infertilità maschile, attraverso l’esame del liquido seminale e il test di capacitazione, delle tecniche di I e II livello, della crioconservazione di gameti (spermatozoi ed ovociti) e di diagnosi pre impianto. Le fasi operative dell’Embriologo affiancano quindi la coppia e il ginecologo durante tutto il percorso di PMA.

L’analisi del liquido seminale (definito spermiogramma) viene svolto seguendo i criteri descritti dal Manuale di laboratorio dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) per l’esame del liquido seminale (Quinta Edizione). Nello spermiogramma sono analizzati e valutati i parametri macroscopici e i parametri microscopici del liquido seminale. I parametri macroscopici sono l’aspetto, la viscosità, il pH e il volume eiaculato. I parametri microscopici sono la forma, la motilità e la concentrazione degli spermatozoi. La forma degli spermatozoi esprime la valutazione della loro conformazione.

La quantità di forme normali deve essere del 4% affinché il campione possa essere considerato nella norma. La valutazione della motilità è utile ad esaminare il numero di spermatozoi che procedono con moto progressivo (cioè che riescono a muoversi normalmente), il numero di quelli che procedono con un moto “in situ” (cioè con spostamenti limitati) e il numero di quelli immobili (cioè quelli che non compiono nessun tipo di movimento).

Affinché un campione di sperma possa essere considerato “normale” (tecnicamente definito normozoospermico), la percentuale di spermatozoi progressivi deve essere almeno del 32%, e il totale tra i progressivi e quelli con moto in situ deve risultare il 40%. La concentrazione degli spermatozoi indica il numero di spermatozoi per millilitro e il numero di spermatozoi per eiaculato (considerando il volume totale di liquido seminale prodotto).

Se si riscontra una anomalia del numero (cioè della concentrazione) di spermatozoi si ha una condizione che viene definita di oligozoospermia; se l’anomalia riguarda il numero di forme allora si parla di teratozoospermia. Se invece il campione ha una percentuale inferiore al 32% di spermatozoi mobili si ha la condizione di astenozoospermia. Queste alterazioni possono essere presenti miste insieme nel caso in cui il campione presenti più di una anomalia: per esempio se il campione presenta anomalie nella motilità e nella concentrazione si ha la oligoastenozoospermia, se sono presenti anomalie nel numero, nella motilità e nella forma si avrà la condizione di oligo-asteno-teratozoospermia.

Una volta effettuata l’analisi del liquido seminale, la coppia verrà chiamata dal Centro per un colloquio col ginecologo, in occasione del quale verrà illustrato quale potrebbe essere il percorso più indicato per quella data coppia.

Tecniche di I e II livello

Come già menzionato, oltre che della diagnostica del liquido seminale, l’Embriologo si occupa anche della preparazione degli spermatozoi per le tecniche di I e di II livello:

1. tecniche di I livello: sono rappresentate dall’inseminazione intrauterina (IUI) e dai suoi vari sottotipi. Tale metodica consiste nella preparazione degli spermatozoi che andranno poi caricati all’interno di un catetere che verrà inserito in cavità uterina alla partner femminile. Con “preparazione” degli spermatozoi s’intende la selezione degli spermatozoi con caratteristiche migliori all’interno del campione, cioè con migliori caratteristiche di motilità e morfologia. Questi saranno caricati poi in un catetere che il Ginecologo provvederà ad iniettare lentamente nella cavità uterina. Nelle tecniche di I livello la fecondazione è intracorporea; avviene all’interno della cavità uterina della partner femminile. L’unico “aiuto” in questo caso è che in laboratorio sono stati concentrati gli spermatozoi con migliori caratteristiche attraverso apposite tecniche (chiamate tecniche di capacitazione del liquido seminale), i quali verranno poi inseriti attraverso il catetere.
2. tecniche di II livello: sono rappresentate dalla fecondazione in vitro, dall’embryo-transfer (FIVET) e dall’iniezione intracitoplasmatica dello spermatozoo nella cellula uovo (ICSI). Nelle tecniche di II livello la fecondazione avviene all’esterno del corpo, cioè “in vitro”: i gameti, cioè gli spermatozoi e gli ovociti, vengono messi a contatto tra loro in laboratorio e soltanto una volta formato l’embrione si procederà con il transfer, cioè col trasferimento dell’embrione nell’utero. La differenza tra FIVET e ICSI è sostanzialmente una: nella FIVET si mettono a contatto una cellula uovo con una concentrazione determinata di spermatozoi, invece nella ICSI si procede ad introdurre uno spermatozoo all’interno dell’ovocita attraverso uno strumento chiamato micromanipolatore. Tramite l’utilizzo di una pipetta di vetro del diametro di pochi micron lo spermatozoo selezionato viene immobilizzato, prelevato e iniettato nel citoplasma di un ovocita maturo. Questa tecnica è maggiormente indicata nei casi di severo fattore maschile (cioè?), in cui non vi sia la possibilità di ottenere la percentuale di spermatozoi necessaria ad una FIVET. A seguito dell’esecuzione del FIVET o della ICSI gli embrioni verranno posti in appositi incubatori. Gli incubatori sono dispositivi per il mantenimento degli embrioni. All’interno di essi vengono impostati determinati valori di temperatura, di ossigeno e di anidride carbonica, al fine di poter mimare le caratteristiche dell’ambiente in cui si troverebbe fisiologicamente “in vivo” nell’organismo.

Coltura embrionale

Circa 17 ore dopo l’avvenuto incontro tra spermatozoi e ovociti si può apprezzare la formazione dei 2 pronuclei, maschile e femminile, fusi tra loro, indici della corretta fertilizzazione (formazione dello zigote). Trascorse 48 ore sarà possibile osservare la formazione del primo stadio di sviluppo embrionale (2-4 cellule); 72 ore dopo si potrà visualizzare un ulteriore stadio di sviluppo embrionario (stadio a 6-8 cellule) e 116 ore si potrà notare invece l’ultimo stadio di sviluppo embrionario in vitro (blastocisti).

La blastocisti è formata da una cavità centrale: il blastocele, delimitato da uno strato compatto di cellule, chiamato trofoectoderma, da cui origineranno i tessuti non embrionali (come ad esempio, la placenta) e da una massa compatta di cellule, l’Inner Cell Mass (ICM), da cui originerà il feto.

Il trasferimento nell’utero della paziente può avvenire dallo stadio di 2 cellule fino allo stadio di blastocisti mediante un apposito catetere, in numero variabile definito dal centro caso per caso.

Crioconservazione

Gli ovociti o embrioni soprannumerari cioè quelli che si sono raccolti al momento del pick-up ovocitario o gli embrioni che si sono formati ma non verranno trasferiti nello stesso ciclo, previo consenso della coppia, verranno crioconservati, cioè mantenuti ad una temperatura di -196°C in contenitori appositi di azoto liquido (tank o criobanca). A questa temperatura, tutti i processi metabolici sono arrestati, le cellule sono in una situazione di “stand by” e lo rimarranno fino a quando non verranno riportate ad una temperatura fisiologica  di 37°C. Una volta scongelate le cellule riprenderanno le loro normali attività metaboliche.

Nel momento in cui la coppia desidererà iniziare un altro ciclo, gli embrioni verranno scongelati e stabilizzati alla temperatura di 37°C, per poi essere trasferiti.

La tecnica di crioconservazione è chiamata vitrificazione. Possono essere vitrificati spermatozoi, ovociti, embrioni e tessuto gonadale.

La crioconservazione è un processo molto importante in quanto permette di crioconservare gameti anche in situazioni patologiche, come ad esempio nel caso di pazienti oncologici o in caso di altre patologie le cui terapie includano trattamenti antiblastici che determinano un grave danno a livello delle gonadi, come la radioterapia o chemioterapia.

Diagnosi Pre-Impianto (PGD)

Compito dell’Embriologo all’interno di un Centro di Procreazione Medicalmente Assistita è anche quello di effettuare la Diagnosi Pre-Impianto (PGD).

La PGD è utilizzata per identificare la presenza di patologie genetiche ereditarie o alterazioni cromosomiche in fasi molto precoci dello sviluppo embrionale, permettendo di trasferire soltanto embrioni sani. Questo esame viene effettuato sulla blastocisti e, attraverso l’utilizzo di uno specifico laser, si provvede a prelevare alcune cellule che saranno poi analizzate da genetisti esperti.

Dott.ssa Maria Luisa Cinti

Fonti bibliografiche

1. Documento per la definizione del profilo professionale dell’embriologo clinico SIERR, Roma, 11/07/2018.
2. ESHRE Revised guidelines for good practice in IVF laboratories Magli et al., 2008
3. WHO Manuale di laboratorio WHO per l’analisi del liquido seminale, V Edizione, 2010
4. Manuale per la gestione di un laboratorio di PMA, Cic Edizioni internazionali, 2017
5. Veeck LL. (1990) The morphological assessment of human oocytes and early conception.
6. La Sala G.B. Infertilità umana, principi e pratica. Edizioni Edra, 2014.